Цитогенетический метод позволяет изучить. Медицинская биология. Показания для исследования полового хроматина
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА
Цитогенетический метод, его значение
Цитогенетический анализ позволяет записывать диагноз наследственного заболевания в виде каріотипічної формулы.
Цитогенетический метод (метод хромосомного анализа) основывается на микроскопическом исследовании структуры и количества хромосом. Он получил широкое применение в 20-е годы XX века, когда были получены первые сведения о количестве хромосом у человека. В 30-х годах были идентифицированы первые 10 пар хромосом.
В 1956 г. шведские ученые Дж. Тийо и А. Леван впервые доказали, что у человека 46 хромосом.
Цитогенетический метод используют для:
Изучение кариотипов организмов;
Уточнение числа хромосомных наборов, количества и морфологии хромосом для диагностики хромосомных болезней;
Составление карт хромосом;
Для изучения геномного и хромосомного мутационного процесса;
Изучение хромосомного полиморфизма в человеческих популяциях.
Хромосомный набор человека содержит большое количество хромосом, основные сведения о которых можно получить при изучении их в метафазе митоза и профазе - метафазе мейоза. Клетки человека для прямого хромосомного анализа получают путем пункции костного мозга и биопсии гонад, или косвенным методом - путем культивирования клеток периферической крови (лимфоциты), когда получают значительное количество метафаз. Косвенным методом исследуют также клетки амниотической жидкости или фибробласты, полученные при амніоцентезі или биопсии хориона, клетки абортусів, мертворожденных и др.
Чаще исследуют хромосомы в лимфоцитах периферической гепаринізованої крови. Для стимуляции митоза добавляют фитогемагглютинин, а для остановки митоза - колхицин. Препарат окрашивают ядерными красителями: 2 % раствором ацеторсеїну, азуреозином, красителем Унна, раствором Гимза и др. Накрывают покровным стеклышком, удаляют избыток красителя фильтровальной бумагой, рассматривают под микроскопом с масляной імерсією.
В последнее время все исследования в цитогенетиці человека проводят с применением методов дифференциального окраска хромосом, которые позволяют отличить каждую хромосомную пару. Существует несколько способов окраски: Q , G , С, R (рис. 1.42). В решении вопросов диагностики хромосомных болезней разные методы дифференциальной окраски применяют в комбинации. Благодаря дифференциальному окраске хромосом можно обнаружить незначительные хромосомные поломки: небольшие делеции, транслокаціїта др.
Получив мікропрепарат, изучают его визуально и составляют ідіограму кариотипа, то есть упорядоченное размещение каждой пары хромосом по индивидуальным признакам различий: общая длина хромосомы, форма, расположение центромеры.
Большинство хромосом по такому методу можно только отнести к определенным группам согласно Денверской классификации (см. раздел 1.2.2.12).
Этот метод позволяет диагностировать много наследственных болезней, изучать мутационный процесс, сложные перестройки и малейшие хромосомные аномалии в клетках, которые вступили в фазу деления и вне делением.
На хромосомный анализ направляются пациенты с множественными врожденными пороками развития, дети с задержкой физического и психомоторного развития, пациенты с недиференційованими формами олигофрении (слабоумия), с нарушением половой дифференцировки, женщины с нарушением менструального цикла (первичная или вторичная аменорея), семьи с бесплодием, женщины с привычным невынашиванием беременности (выкидыши, мертворожденные).
Цитогенетика представляет собой самостоятельный раздел учения о наследственности, в котором исследуются различные, прежде всего, наблюдаемые (эксплицированные) носители, содержащие в себе информацию о генетической наследственности. Такими носителями выступают хромосомы различных типов (политенные, митотические и мейотические), пластиды, интерфазные ядра, и, в наименьшей степени - митохондрии.
Исходя из этого, цитогенетический метод представляет собой совокупность способов и технологий изучения, прежде всего, хромосом, в ходе которых устанавливается их количественный параметр, производится их химико-биологическое описание, исследуется структура и режимы поведения во время клеточного деления. Научной задачей данного исследования является установление связи между характером и динамикой изменения структуры хромосом и картиной, отражающей изменчивость признаков.
Одним из важнейших направлений исследования, которое предполагает цитогенетический метод, является проведение анализа кариотипа человека. Данное исследование, как правило, проводят на культурах, в которых происходит деление половых и соматических клеток.
Самая распространенная культура для такого рода исследований - клетки периферической крови, такие как лимфоциты, фибробласты и клетки костного мозга. Самой доступной культурой, используемой в медицинской цитогенетике, являются лимфоциты крови. Причина этого состоит в том, что, как правило, они являются предметом анализа и в При плода цитогенетический метод предполагает использование клеточных культур, выбор которых обусловлен рядом факторов. Главным из них является срок беременности. Например, при этом сроке менее 12 недель, цитогенетический анализ хромосом лучше всего производить с участием клеток хориона, а при сроках беременности более 12 недель, целесообразно для исследования рассматривать клетки самого плода. Для этой цели они специально выделяются из плаценты и крови плода.
Для установления кариотипа цитогенетический наследственности требует получения образца крови в количестве не менее 1-2 мл. При этом сам метод предполагает ведение исследования, состоящего из трех основных этапов:
Выделение и на которых будет осуществляться анализ;
Окраска препарата;
Проведение тщательного анализа препарата под микроскопом.
Эффективным цитогенетический метод генетики может быть только тогда, когда будут соблюдены следующие условия. Во-первых, должно быть определенное количество клеток, находящихся в метафазной стадии. Во-вторых, культивирование должно проводиться в строгом соответствии с установленными правилами и в течение периода не менее 72 часов. В-третьих, фиксация клеток должна производиться раствором и метанола в строгом соотношении этих веществ 3: 1.
На этапе окраски препарата для выбор цветов производится с учетом самой цели исследования, то есть, какой тип перестроек необходимо изучить. Чаще всего, используют метод сплошного окрашивания, так как он наиболее прост для определения количественного параметра хромосом. Современные исследования больше всего применяют данный метод окрашивания для определения аномалий кариотипа в их количественном выражении. Но такой цитогенетический метод не дает возможности определить и выявить структурную динамику хромосом. Поэтому применяют другие, специальные методы, которые позволяют нивелировать данный недостаток метода сплошного окрашивания. Наиболее распространенные из них, такие как метод дифференцированной окраски, G-метод, R-метод и иные.
И, наконец, третий этап исследования состоит в микроскопическом изучении окрашенных хромосом, находящихся в метафазной стадии. В ходе него устанавливается количество нормальных и аномальных по своему состоянию клеток организма плода человека. Для этого, как правило, проводится анализ нескольких тканей.
Клиническая генетика. Е.Ф. Давыденкова, И.С. Либерман. Ленинград. «Медицина». 1976 год.
ВЕДУЩИЕ СПЕЦИАЛИСТЫ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ
Амелина Светлана Сергеевна - профессор кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, доктор медицинских наук. Врач генетик высшей квалификационной категории
Дегтерева Елена Валентиновна - ассистент кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, врач-генетик первой категории
Редактор страницы: Крючкова Оксана Александровна
К цитогенетическим методам, применяемым в клинике, относятся определение полового хроматина (X- и У-хроматина) в интерфазных ядрах различных тканей, морфологических особенностей хроматина в нейтрофилах периферической крови (барабанные палочки), а также исследование хромосом на стадии метафазы митоза для определения кариотипа.
Исследование полового хроматина
В 1949 г. Ваrr и Bertram описали в интерфазных ядрах компактное скопление хроматина в виде темноокрашенного тельца, получившее название полового хроматина (sex chromatin). В норме он встречается у женщин, у мужчин он отсутствует или представлен в незначительном количестве. У мужчин, имеющих одну Х-хромосому, она всегда активна, у женщин активной является только одна из двух Х-хромосом, вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии. Она образует тельце полового хроматина, которое определяется в интерфазном ядре клетки женского организма. Был разработан простой и быстрый метод определения Х-хроматина в мазках слизистой полости рта с окраской препаратов ацетоорсеином. Быстрота и легкость выполнения привели к широкому применению этого метода в медицинской практике.
Метод, до настоящего времени имевшийся в нашем распоряжении, выявлял только Х-хроматин, т. е. хроматин, образованный инактивированной Х-хромосомой. С момента опубликования исследований Caspersson с соавт. (1969, 1970) появились возможности определения У-хроматина при помощи люминесцентно-микроскопического исследования. Работами Zech (1969) было показано, что часть длинного плеча У-хромосомы флюоресцирует при окрашивании акрихин-ипритом. Затем Pearson с сотр. (1970) обнаружили, что в интерфазном ядре клеток мужчин имеется флюоресцирующее тельце, названное ими F-тельцем, которое у мужчин с кариотипом ХУУ имеется в двойном количестве. Таким образом, появился
простой метод определения У-хроматина в буквальных соскобах, который может быть применен для клинических целей. Это очень удобно для популяционных исследований, так как полное карио- типирование является сложным и трудоемким.
Таким образом, в настоящее время необходимо дифференцировать X-хроматин и У-хроматин.
Исследование Х-хроматина. Х-хроматин может быть определен в различных тканях организма: в клетках кожи, слизистой оболочки рта, уретры, влагалища, в клетках крови, в клетках волосяной луковицы, в эпителиальных клетках осадка мочи, в амниотической жидкости и др. Он может быть исследован и в посмертном материале, например в клетках почечных канальцев мертворожденных детей (Н_ П. Бочков и сотр., 1966).
Наиболее распространенным является определение полового хроматина в буккальных мазках по методу Sanderson и Stewart (1961) с одномоментной фиксацией и окраской препаратов ацетоорсеином.
Соскоб берется металлическим шпателем с внутренней поверхности щеки, наносится равномерным слоем на предметное стекло, окрашивается одной каплей 1,5% или 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина. Раствор красителя готовится следующим образом: в 45 мл ледяной уксусной кислоты растворяется 1,5-2 г орсеина; раствор нагревается до появления паров, добавляется 55 мл дистиллированной воды и после охлаждения фильтруется. Затем препарат накрывается покровным стеклом, на которое производится легкое надавливание через сложенную в 3-4 слоя марлю или фильтровальную бумагу для удаления лишней краски. На приготовление препарата требуется 2-3 мин. Если препараты просматриваются не сразу, то края покровного стекла покрываются парафином для предупреждения от высыхания. В таком виде препараты можно сохранять в холодильнике до 2 суток.
Ацетоорсеин окрашивает Х-хроматин в темно-фиолетовый цвет, а нуклеоплазму - в бледно-розовый.
Для более контрастного окрашивания Х-хроматина или при отсутствии ацетоорсеина в нашей лаборатории с успехом применяется метод окраски, разработанный сотрудником нашей лаборатории- А. М. Захаровым. Он основан на метахроматическом окрашивании гетерохроматина красителями тиозиновой группы: метиленовый синий, азур I. Эти красители отечественного производства обычно имеются в достаточном количестве в любой лаборатории.
Применяется 0,2-0,5% раствор одного из вышеуказанных красителей в дистиллированной воде. Разведение проводится из расчета 20-50 мг красителя на 10 мл Н20. Для приготовления одного препарата требуется 2-3 капли раствора. Требуется довести раствор до pH 4,3-4,7 несколькими каплями фосфатного буфера. Употребление буфера не всегда обязательно, так как при растворении краситель сам снижает значение pH до нужной величины. Приготовление препаратов проводится таким же образом, как при ацетоорсеиновом методе.
В отличие от орсеинового метода окрашивание производится без одновременной фиксации кислотой, что предотвращает сморщивание части клеток, поэтому количество Х-хроматина при подсчете превышает в среднем на 5% то количество, которое получается при ацетоорсеиновом методе. При этом методе окрашивания цитоплазма клеток эпителия бесцветна, ядра приобретают бледно-фиолетовый цвет, тельце полового хроматина окрашивается более интенсивно и имеет красноватый цвет.
Для подсчета полового хроматина используются микроскопы МБИ- 3 или МБИ-6 с иммерсионными объективами. Подсчитывается не менее 100 пригодных для анализа ядер, при этом учитываются ядра с ровным контуром, гладкой оболочкой и половым хроматином, прилегающим к ядерной оболочке. Просматривается обычно несколько полей зрения в разных местах препарата.
По количеству телец Х-хроматина можно судить о количестве Х-хромосом. Число Х-хромосом всегда на единицу больше числа телец полового хроматина.
В последние годы получило распространение определение полового хроматина в клетках опухолей. Обнаруживается несоответствие между полом больного и «клеточным полом» опухоли. Выявляется также зависимость между содержанием полового хроматина и чувствительностью опухоли к гормонотерапии.
Исследование У-хроматина. Определение У-хроматина в ядрах клеток на стадии интерфазы может быть осуществлено при применении флюорохромных красителей, таких как акрихин или акрихин-иприт с последующей люминесцентной микроскопией. Таким образом могут быть идентифицированы хромосомы на стадии метафазы митоза, а, также хроматин в ядрах клеток. Акрихин-иприт окрашивает дистальные участки длинных плеч У-хромосомы в метафазе. Кроме того, маленькие округлые флюоресцирующие
тельца наблюдаются в интерфазных ядрах. Они встречаются у лиц мужского пола и могут рассматриваться как У-хроматин. При хромосомных нарушениях типа ХУУ наблюдается два тельца У-хроматина (рис 5). Большие популяционные исследования показали, что наиболее удобными для выявления У-хроматина
Рис. 5. Два флюоресцирующих тельца У-хроматина в интерфазном ядре больного с синдромом 47, XYY.
Окраска акрихин-ипритом.
являются эпителиальные клетки слизистой щеки и лимфоциты периферической крови (Pearson и сотр., 1970; I’olani и Multon, 1971; Robinson, 1971).
Сейчас усиленно изучаются особенности F-хроматина в норме и патологии, вариации в связи с возрастом, различным состоянием организма, корреляцией с размером флюоресцентной части метафазной У-хромосомы и др.
Соскоб эпителия слизистой щеки, полученный при помощи шпателя, наносится ровным слоем на покровное или предметное стекло. Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 2 мин, а затем проводят через нисходящий ряд спиртов (этиловый спирт), выдерживая по 30 с в каждом, до воды. Мазок помещают в буфер Мак-Илвейна (pH 7,0) на 8 мин при 8°. Мазки окрашивают в течение 8-10 мин в 0,005% растворе акрихин-иприта. Затем препараты споласкивают в свежей водопроводной воде и дифференцируют в двух-трех порциях цитратно- фосфатного буфера Мак-Илвейна по 1-2 мин и заключают в смесь вода-глицерин (1: 1). Излишки среды тщательно удаляют фильтровальной бумагой и края покровного стекла заливают парафином.
Препараты анализируют под люминесцентным микроскопом (МЛ-2 или МЛ-3, лампа ДРШ 250 с фильтром ФС-2 и СС-2 и барьерным фильтром ЖС 18 + ЖЗС 19).
В ядрах клеток буквального эпителия У-хроматин обнаруживается в виде ярко светящихся телец на фоне умеренного свечения остального хроматина ядра. Общее количество клеток с У-хроматином колеблется от 33 до 92%. Размер одиночного тельца У-хроматина около 0,25-0,8 мкм в диаметре. Но У-хроматин может быть представлен в виде одной, двух, трех и более мелких глыбок в ядре. Интерфазный У-хроматин коррелируется с вариациями в размерах флюоресцирующих участков У-хромосом в метафазных пластинках.
Исследование У-хроматина люминесцентно-микроскопическим методом в комплексе с методом определения Х-хроматина дает возможность выявлять набор половых хромосом без кариотипирования. Исследование эндоцервикальных мазков с помощью флюоресцентной методики можно использовать для пренатального определения пола.
В генетике человека используются разнообразные методы исследования, применяемые и в других разделах биологии - генетике, физиологии, цитологии, биохимии и др. Антропогенетика располагает также собственными методами исследования: цитогенетическим, близнецовым, генеалогическим и др. 4
Достижениями молекулярной биологии и биохимии внесен большой вклад в развитие генетики. В настоящее время биохимическим и молекулярно-генетическим методам исследования принадлежит ведущая роль в генетике человека и медицинской генетике. Однако и классические методы генетики человека, такие как цитогенетический, генеалогический и близнецовый, имеют существенное значение в настоящее время, особенно в вопросах диагностики, медико-генетического консультирования и прогнозирования потомства.
Ознакомимся с возможностями цитогенетического метода.
Суть этого метода заключается в изучении строения отдельных хромосом, а также особенностей набора хромосом клеток человека в норме и патологии. Удобным объектом для этого служат лимфоциты, клетки эпителия щеки и другие клетки, которые легко получать, культивировать и подвергать кариологическому анализу. Это важный метод определения пола и хромосомных наследственных заболеваний человека.
Основой цитогенетического метода является изучение морфологии отдельных хромосом клеток человека. Современный этап познания строения хромосом характеризуется созданием молекулярных моделей этих важнейших структур ядра, изучением роли отдельных компонентов хромосом в хранении и передаче наследственной информации.
В главе 1 мы рассмотрели такие компоненты хромосом, как белки и нуклеиновые кислоты. Здесь же кратко остановимся на строении и морфологии хромосом.
Строение хромосом.
Хромосомную теорию наследственности создал американский ученый Т. Г. Морган. Проведя большое количество исследований на плодовой мушке дрозофиле, Морган и его ученики установили, что именно в хромосомах находятся открытые Менделем факторы наследственности, которые были названы генами. Т. Морган и его ученики показали, что гены расположены линейно по длине хромосомы.
После того как было доказано, что хромосомы являются основными генофорами (носителями генов), начался период их наиболее интенсивного изучения. Успехи молекулярной биологии и генетики позволили понять некоторые закономерности строения и функционирования хромосом прокариот и эукариот, однако многое здесь остается еще неизвестным. В последние годы хромосомы эукариот, особенно человека, становятся предметом изучения различных специалистов, начиная от генетиков и кончая физиками.
Внастоящее время установлено, что в основе строения хромосомы лежит хроматин - сложный комплекс ДНК, белков, РНК и других веществ, входящих в хромосому (строение хроматина мы подробно рассмотрели в главе 1). Предполагается, что в хромосому человека входит одна гигантская молекула ДНК, молекулы РНК, гистоны и кислые белки, различные ферменты, фосфолипиды, металлы Са 2+ , Mg 2+ и некоторые другие вещества. Способ укладки и взаимного расположения молекул этих химических соединений в хромосоме пока не известен. Длинная нить ДНК не может располагаться в хромосоме беспорядочно. Существует предположение, что нить ДНК упакована закономерным образом и связана с белками.
Ф. Арриги и соавторы (1971) установили, что уникальные последовательности занимают более 56% ДНК хромосом человека, высокоповторяющиеся - 12,4 %, промежуточные повторы - 8 %. Общее количество повторяющихся генов в ДНК хромосомы человека равно 28%. Число хромосом у человека длительное время оставалось невыясненным. Дело в том, что определить количество хромосом у млекопитающих, особенно у человека, было трудно. Хромосомы оказались маленькими, весьма многочисленными, плохо поддавались подсчету. При фиксации клетки они сливались в комки, что затрудняло определение истинного числа хромосом. Поэтому первые исследователи не могли точно и правильно подсчитать количество хромосом в клетках человека. Называлось разное количество хромосом - от 44 до 50.
О
бычно
хромосомы в клетках наблюдают во время
митоза на стадии метафазной пластинки.
В интерфазном ядре хромосомы в световой
микроскоп не видны. В
1912 г. Г.
Винивартер, изучая хромосомы в
сперматогониях и оогониях половых желез
человека, удаленных во время операции,
установил, что мужской набор хромосом
(кариотип) содержит
47 хромосом,
а женский
- 48. В
1922 г. Т.
Пайнтер повторил исследования Винивартера
и установил, что мужской и женский
кариотипы содержат по
48 хромосом,
но женский отличается от мужского только
двумя хромосомами. У женщин находится
2 большие
половые хромосомы, а у мужчины одна
большая Х-хромосома и одна маленькая
К-хромосома. В последующие годы эту
точку зрения поддерживали и другие
ученые. П. И. Живаго и А. Г. Андреа
(1932) предложили
первую классификацию хромосом в
зависимости от их длины. Так как хромосомы
очень близко располагаются одна около
другой и их очень трудно исследовать,
то и в последующие годы точное число
хромосом у человека служило предметом
споров и дискуссий. Однако постепенно
было достигнуто согласие между
исследователями по этому вопросу, и в
течение
30 лет
большинство цитогенетиков считало, что
у человека диплоидное число хромосом
равно 48,
а гаплоидное
- 24.
Усовершенствованные методы изучения
хромосом позволили получить более
точные сведения о количестве хромосом
в клетках у человека, а также выявить
аномалии нормального кариотипа,
ответственные за некоторые уродства.
Особенно плодотворным оказались два
метода:
1. Обработка культуры клеток алкалоидом колхицином, который ведет к накоплению делящихся клеток на стадии метафазы;
2. Обработка клеток слабыми растворами солей, вызывающими набухание, расправление хромосом, что облегчает их исследование.
В 1956 г. шведские цитологи Дж. Тийо и А. Леван изготовили культуры клеток из тканей легких, взятых у абортированных человеческих эмбрионов и, используя усовершенствованную методику обработки клеток, получили необычайно четкие препараты, в которых ясно было видно 46 хромосом. 5
Несколькими месяцами позднее Ч. Форд и Дж. Хаммертон в Англии установили, что диплоидные предшественники половых клеток в семенниках мужчин (сперматогонии) также имеют по 46 хромосом, а гаплоидные (сперматоциты 1-го деления) - по 23 хромосомы.
После этого были изучены многие клетки из разных органов и тканей человека и везде нормальное число хромосом оказалось равным 46.
Женский кариотип отличается от мужского только одной половой хромосомой. Остальные 22 пары одинаковы у мужчин и женщин. Эти 22 пары хромосом называются аутосомами. Нормальный кариотип состоит из 44 аутосом (22 пары) и двух половых хромосом - XX у женщин и XY у мужчин, т. е. женский кариотип имеет две большие половые хромосомы, а мужской - одну большую и одну маленькую.
В половых клетках человека находится одинарный (гаплоидный) набор хромосом - 23, а в соматических клетках - двойной (диплоидный) набор - 46. Эти открытия стимулировали дальнейшее изучение хромосом. Были разработаны методы исследования хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови и на других объектах. В настоящее время хромосомы относительно легко исследуют в лимфоцитах периферической крови. Венозную кровь помещают в специальную питательную среду, добавляют фитогемаглютинин, который стимулирует клетки к делению, и помещают на 72 ч. в термостат. За 6 ч. до конца инкубации сюда добавляют колхицин, который задерживает процесс деления клеток на стадии метафазной пластинки. Затем культуру помещают в гипотонический раствор NaCl, в котором клетки набухают, что приводит к легкому разрыву оболочек ядра и переходу хромосом в цитоплазму. После этого препараты окрашивают ядерными красителями, в частности ацетоорсеином, и рассматривают их в световом микроскопе с иммерсией.
Под микроскопом учитывают общее количество хромосом, фотографируют их, затем из фото вырезают ножницами каждую хромосому и наклеивают на чистый лист бумаги в ряд, начиная от самой большой (первой) хромосомы и кончая самой маленькой (двадцать второй) и половой Y-хромосомой. Люминесцентная методика позволяет быстро и просто проводить массовые исследования с целью выявления больных с различными типами хромосомных аномалий. Совокупность количественных (число хромосом и их размеры) и качественных (морфология хромосом) признаков диплоидного набора единичной клетки обозначается термином «кариотип». Строение хромосом изменяется в зависимости от стадии деления клеток (профазы, метафазы, анафазы, телофазы).
Уже в профазе митоза видно, что хромосома образована двумя взаимно переплетающимися нитями одинакового диаметра - хроматидами. В метафазе хромосома уже спирализована, и две ее хроматиды ложатся параллельно, разделенные узкой щелью. Каждая хроматида состоит из двух полухроматид. В результате митоза хроматиды материнской хромосомы становятся сестринскими хромосомами, а полухроматиды - их хроматидами. В основе хроматид лежат хромонемы - так называют более тонкие нити ДНП, состоящие из белка и нуклеиновых кислот.
В интерфазе
(промежуток между двумя делениями
клеток) хроматин тесно связан с
ядерными мембранами и ядерным белковым
матриксом. Он образует также большие
участки деспирализованных нитей
ДНП. Затем постепенно хроматин
спирализуется, образуя типичные
метафазные х
ромосомы.
Размеры их варьируют от
2 до
10 микрон.
В настоящее время интенсивно исследуются структурные особенности аутосом и половых хромосом (на клетках костного мозга, лимфоцитах, фибробластах, клетках кожи, регенерирующей печени).
Вхромосомах выявлены структуры, названные хромомерами. Хромомер - это спирализованный участок хромонемы. Промежутки между хромомерами представлены хромонемными нитями. Расположение хромомеров на каждой хромосоме строго фиксировано, наследственно детерминировано.
Хромомер - сравнительно крупная генетическая единица, сравнимая по длине с хромосомой кишечной палочки. Строение и функция хромомера - основная загадка современной генетики. Предполагают, что некоторые хромомеры - это один генетический локус, где есть один структурный ген и много генов регуляторных. Возможно, в других хромомерах располагается несколько структурных генов.
Хромонемы и хромомеры окружены неокрашивающимся веществом - матриксом. Полагают, что матрикс содержит дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты, белки.
Определенные участки хромосом образуют ядрышки. Ядрышки - это более или менее деспирализованные участки хромосом, окруженные продуктами деятельности генов (рибосомы, частицы РНК и т. п.). Здесь идет синтез рибосомальной РНК, а также осуществляются определенные этапы формирования рибосом. В нем синтезируется большая часть РНК клетки.
В метафазной хромосоме различают еще несколько образований: центромеру, два плеча хромосомы, теломеры и спутник.
Центромерный (meros - по-гречески, часть) участок хромосомы - это неокрашивающийся разрыв в хромосоме, видимый на препарате хромосом. Центромера содержит 2-3 пары хромомер, имеет сложное строение. Предполагают, что она направляет движение хромосомы в митозе. К центромерам прикрепляются нити веретена.
Теломеры - специальные структуры на концах хромосом - также имеют сложное строение. В их состав входит несколько хромомер. Теломеры предотвращают концевое присоединение метафазных хромосом друг к другу. Отсутствие теломеров делает хромосому «липкой» - она легко присоединяется к другим фрагментам хромосом.
Одни участки хромосомы называются эухроматиновыми, другие - гетерохроматиновыми. Эухроматиновые районы хромосом - это генетически активные участки, они содержат основной комплекс функционирующих генов ядер. Потеря даже мельчайшего фрагмента эухроматина может вызвать гибель организма. Гетерохроматиновые районы хромосом - обычно сильно спирализованы и, как правило, генетически мало активны. В гетерохроматине находится ядрышковый организатор. Потеря даже значительной части гетерохроматина часто не приводит организм к гибели. Гетерохроматиновые участки хромосомы реплицируются позднее, чем эухроматиновые. Следует помнить, что эухроматин и гетерохроматин - это не вещество, а функциональное состояние хромосомы.
Если расположить фотографии гомологичных хромосом по мере возрастания их размеров, то можно получить так называемую идиограмму кариотипа. Таким образом, идиограмма - это графическое изображение хромосом. На идиограмме пары гомологов располагаются рядами в порядке убывающего размера.
У человека на идиограмме среди 46 хромосом различают три типа хромосом в зависимости от положения в хромосоме центромер:
1. Метацентрические - центромера занимает центральное положение в хромосоме, оба плеча хромосомы имеют почти одинаковую длину;
2. Субметацентрические - центромера располагается ближе к одному концу хромосомы, в результате чего плечи хромосомы разной длины.
Классификация хромосом человека по размеру и расположению центромера |
||
Группа хромосом |
Номер по кариотипу |
Характеристика хромосом |
1 и 3 почти метацентрические и 2-крупная субметацентрическая |
||
крупные субакроцентрические |
||
средние субметацентрические |
||
средние акроцентрические |
||
мелкие субметацентрические |
||
самые мелкие мегацентрические |
||
самые мелкие акроцентрические |
||
Х-хромосома (относится к III группе |
средняя почти метацентрическая |
|
Y-хромосома |
мелкая акроцентрическая |
3. Акроцентрические - центромера находится у конца хромосомы. Одно плечо очень короткое, другое длинное. Хромосомы не очень легко отличать одну от другой. Цитогенетики с целью унификации методов идентификации хромосом на конференции в 1960 г. в г. Денвере (США) предложили классификацию, учитывающую величину хромосом и расположения центромер. Патау в том же году дополнил эту классификацию и предложил разделить хромосомы на 7 групп. Согласно этой классификации, к первой группе А относятся крупные 1, 2 и 3 суб- и акроцентрические хромосомы. Ко второй группе В - крупные Субметацентрические пары 4-5. К третьей группе С относятся средние субакроцентрические (6-12 пары) и Х-хромосома, которая по величине находится между 6 и 7 хромосомами. К группе Д (четвертой) относятся средние акроцентрические хромосомы (13, 14 и 15 пары). К группе Е (пятой)- мелкие Субметацентрические хромосомы (16, 17 и 18 пары). К группе F (шестой) мелкие метацентрические (19 и 20 пары), а к группе G (седьмой) - самые мелкие акроцентрические хромосомы (21 и 22 пары) и мелкая акроцентрическая половая Y-хромосома (табл. 4).
Существуют и другие классификации хромосом (Лондонская, Парижская, Чикагская), в которых развиты, конкретизированы и дополнены положения Денверской классификации, что в конечном итоге облегчает идентификацию и обозначение каждой из хромосом человека и их частей.
Акроцентрические хромосомы IV группы (Д, 13-15 пары) и группы VII (G, 21-22 пары) на коротком плече несут маленькие дополнительные структуры, так называемые сателлиты. В некоторых случаях эти сателлиты являются причиной сцепления хромосом между собой при делении клеток в мейозе, вследствие чего происходит неравномерное распределение хромосом. В одной половой клетке оказывается 22 хромосомы, а в другой - 24. Так возникают моносомии и трисомии по той или иной паре хромосом. Фрагмент одной хромосомы может присоединиться к хромосоме другой группы (например, фрагмент 21 или 22 присоединяется к 13 или 15). Так возникает транслокация. Трисомия 21-й хромосомы или транслокация ее фрагмента являются причиной болезни Дауна.
Внутри семи этих групп хромосом на основании лишь внешних различий, видимых в простой микроскоп, провести идентификацию хромосом почти невозможно. Но при обработке хромосом акрихини притом и при помощи ряда других методов окраски их можно идентифицировать. Известны различные
способы дифференциальной окраски хромосом по Q-, G-, С-технике (А. Ф.Захаров, 1973) (рис. 27). Назовем некоторые методы идентификации индивидуальных хромосом человека. Широко применяются различные модификации так называемого метода Q. Например, метод QF - с использованием флюорохромов; метод QFQ - с использованием акрихина; метод QFH - с использованием специального красителя фирмы «Хекст» № 33258, выявляющего повторяющиеся последовательности нуклеотидов в ДНК хромосом (сателлитную ДНК и т. п.). Мощным средством изучения и индивидуальной характеристики хромосом являются модификации трипсинового метода GT. Назовем, например, GTG-метод, включающий обработку хромосом трипсином и окраску красителем Гимза, GTL-метод (обработка трипсином и окраска по Лейтману).
Известны методы с обработкой хромосом ацетатными солями и красителем Гимза, методы с использованием гидроокиси бария, акридиноранжа и другие.
ДНК хромосом выявляется при помощи реакции Фельгена, окраски метиловым зеленым, акридиноранжем, красителем № 33258 фирмы «Хекст». Акридиноранжевый краситель с ДНК однонитчатой образует димерные ассоциаты и дает красную люминесценцию, с двунитчатой спиральной ДНК образует одномерные ассоциаты и люминесцирует зеленым светом.
Измеряя интенсивность красной люминесценции, можно судить о количестве свободных мест в ДНП и хроматине, а отношение зеленая - красная люминесценция - о функциональной активности хромосом.
Гистоны и кислые белки хромосом выявляются при различных рН окраской бромфенодовым синим, зеленым прочным, серебрением, иммунолюминесцентным методом, РНК - окраской галлюцианиновыми квасцами, красителем фирмы «Хекст» № 1, акридиноранжем при нагревании до 60°.
Широко применяются электронная микроскопия, гистоавторадиография и ряд других методов.
В 1969 г. шведский биолог Т. Касперссон и его сотрудники показали, что хромосомы, окрашенные горчичным акрихином и освещенные под микроскопом Наиболее длинноволновой частью ультрафиолетового спектра, начинают люминесцировать, причем одни участки хромосом светятся ярче, другие слабее. Причина этого - разный химический состав поверхности хромосомы. В последующие годы исследователи обнаружили, что концы Y-хромосомы человека светятся ярче любой другой хромосомы человека, поэтому Y-хромосому легко заметить на препарате.
Акрихиниприт преимущественно связывается с ГЦ-парами ДНК. Флюоресцируют отдельные диски гетерохроматиновых участков. Удаляют ДНК - свечение исчезает. Составлены карты флюоресцирующих хромосом. Из 27 видов млекопитающих только у человека, шимпанзе, гориллы и орангутанга светятся Y-хромосомы. Свечение связано с повторами генов, которые появились в эволюции 20 млн. лет назад.
Итак, в норме в соматических клетках человека находится 46 хромосом (23 пары), а в половых - 23 хромосомы, по одной хромосоме каждой пары. При слиянии сперматозоида и яйцеклетки в зиготе количество хромосом удваивается. Таким образом, каждая соматическая клетка организма человека содержит один набор отцовских хромосом и один набор материнских хромосом. Если у человека 46 хромосом, то у различных обезьян число хромосом равно 34, 42, 44, 54, 60, 66.
При действии ультразвука или высокого давления можно добиться разрыва нитей ДНК, которые входят в состав хромосомы, на отдельные фрагменты. Подогревая растворы ДНК до температуры 80-100°,
можно вызвать денатурацию ДНК, расхождение двух составляющих ее нитей. При определенных условиях разъединенные нити ДНК могут снова реассоциировать в устойчивую двунитчатую молекулу ДНК (реассоциация или ренатурация ДНК). Денатурацию и ренатурацию ДНК можно получить и на препаратах фиксированных хромосом, обрабатывая их соответствующим образом. Если после этого хромосомы окрасить красителем Гимза, то в них выявляется четкая поперечная исчерченность, состоящая из светлых и темных полос. Расположение этих полос в каждой хромосоме разное. Таким образом, по «Гимза-дискам» можно также идентифицировать каждую из 23 пар хромосом.
Этими и другими методиками, особенно гибридизацией соматических клеток различных животных и человека, пользуются для картирования хромосом, т. е. для определения положения разных генов в той или иной хромосоме. В настоящее время в аутосомах и половых хромосомах человека картировано около 200 генов.
На конец 1975 г. было локализовано следующее количество генов в различных хромосомах человека (А. Ф. Захаров, 1977): 1 хромосома - 24 гена; 2 хромосомы - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14-3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y-хромосома - 2; Х-хромосома - 95 генов.
Цитогенетическое исследование - это микроскопический анализ хромосом, результаты которого весьма важны для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего - онкогематологических. Значение цитогенетических методов для диагноза и лечения определяется доступностью опухолевых клеток для кариотипирования и их гетерогенностью, а с научной точки зрения - возможностью изучения изменений в структуре и функции генетических локусов, ассоциированных со злокачественной трансформацией.
Морфология хромосом
сильно варьирует во время клеточного цикла. Для микроскопического анализа хромосомы должны быть визуализированы как дискретные структуры. Наилучшим образом это достигается на стадии прометафазы митоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды, и особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Нормальные клетки
человека содержат 22 пары аутосом и одну пару половых : две Х-хромосомы у женщин и по одной копии половых хромосом (X и Y) у мужчин.
Для цитогенетического анализа лейкозов , миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний исследуют клетки костного мозга. При невозможности их получения может быть исследована кровь (если она содержит бласты). Цитогенетический анализ лимфом выполняется в клетках ткани лимфатического узла. Культивирование клеток из опухоли повышает митотический индекс (пропорцию клеток, находящихся в фазе митоза) и способствует пролиферации злокачественных клеток.
Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения - фитогемагглютинином.
Окрашивание хромосом в гематологии
В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом , а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).
Достаточно большое количество профазных и прометафазных клеток для анализа получают путем синхронизации клеточного цикла, культивируя клетки в среде, содержащей антиметаболит (например, метотрексат), который ингибирует синтез ДНК. Подавление синтеза ДНК останавливает клеточный цикл в интерфазе. Затем клетки переносят в среду без метотрексата, обогащенную тимидином, где они одновременно входят в фазу митоза. Обработка клеточной культуры колхицином останавливает митоз одновременно во всех клетках на стадии профазы или прометафазы.
Первая стойкая хромосомная аномалия при злокачественной опухоли человека была выявлена в 1960 г. у больных хроническим миелолейкозом и получила название филадельфийской хромосомы (Ph), по имени города, в котором было сделано это открытие. Применение технологии хромосомного окрашивания позволило выявить множество хромосомных аномалий, большая часть которых встречается при онкогематологических заболеваниях. Некоторые красители окрашивают различные участки хромосом с вариабельной интенсивностью в зависимости от структуры хроматина в этих участках, их нуклеотидного и белкового состава.
В результате такого окрашивания получают уникальный паттерн чередования светлых и темных поперечных полос, специфичный для каждой хромосомы.
В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом . При Q-окрашивании акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом выявляется особый тип флюоресценции каждой хромосомы с образованием Q-исчерченности (Q-banding) - поперечных флюоресцентных полос, называемых Q-полосами (Q.-bands). Это позволяет идентифицировать отдельные хромосомы. Анализ Q-полос выполняют с помощью флюоресцентного микроскопа.
Схема анализа ДНК методом FISHПри окрашивании по Гимзе (G-banding) хромосомы приобретают вид серии темных и светлых полос или бэндов (bands). G-окрашивание применяется чаще, чем Q-окрашивание, так как анализ выполняется с помощью светового микроскопа, а G-полосы, в отличие от Q-полос, не выцветают со временем. Наиболее широко применяется методика, называемая GTG-окрашиванием (G bands by trypsin using Giemsa), с предварительной обработкой трипсином.
R-бэндинг (обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе) выявляет полосы, которые обратны G-полосам и называются R-полосами (reverse of G bands).
Помимо Q-, G- и R-окрашивания , позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание - от англ. constitutive), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание - от англ. nucleolus organizing region). Размеры и положение С-полос уникальны для каждой хромосомы, но преимущественно они включают центромерныи район и используются при исследовании хромосомных транслокаций, вовлекающих центромерные районы хромосом.
Цитогенетический анализ опухолевых клеток затруднен в связи с неясной морфологией хромосом и слабой различимостью полос. Если в исследование взяты наиболее удобные для анализа метафазные пластинки, образец может быть ошибочно охарактеризован как цитогенетически нормальный.
С развитием методов рекомбинантной ДНК стало возможным использование гибридизации in situ для определения местоположения на хромосомах или в клеточном ядре любой ДНК- и РНК-последовательности. С ее помощью можно изучать и диагностировать онкологические и наследственные генетические болезни. Молекулярная гибридизация in situ является важным инструментом цитогенетических исследований, позволяет выявлять хромосомные перестройки, идентифицировать маркерные хромосомы, проводить быстрое кариотипирование клеточных линий. Важно, что подобный анализ можно проводить не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах.
Разрешающая способность «интерфазной цитогенетики» на два порядка выше, чем классической цитогенетики.
Несмотря на многоцелевое использование молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (РНК) in situ , все модификации метода выполняются в соответствии с общими принципами. Существуют несколько вариантов, которые включают в себя несколько этапов: подготовка и мечение ДНК (РНК)-зонда, приготовление препаратов хромосом, собственно гибридизация, детекция гибридных молекул.
В 1980-х годах цитогенетическая методология обогатилась молекулярно-цитогенетическим методом, называемым флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization , FISH ), который вскоре стал наиболее популярным. Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).
Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами , становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.
Флюорохром может быть связан с ДНК ковалентно (прямое мечение) или посредством иммуноцитохимических реакций, когда ДНК-зонд метят гаптеном (биотин, дигоксигенин), а флюорохром связан с алкалоидом авидином (стрептавидином), обладающим сильным сродством к биотину (или с антителами против биотина или дигоксигенина). При использовании гаптенов возможна амплификация флюоресцентного сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и вторичных антител, специфичных предыдущему слою антител и окрашенных флюорохромом.
Для амплификации флюоресцентного сигнала применяется метод «иммунных сэндвичей». Например, на препарат, изображенный на схеме, наносят биотинилированные антитела к авидину, а затем снова комплекс авидин-флюоресцеин. При необходимости цикл может быть повторен. Антитела в свою очередь выявляются с помощью ферментативного (например, авидинпероксидазы) или флюоресцентного детектора.
Метод FISH
предназначен для выявления:
1) гибридных клеток;
2) транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
3) меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.
Высококонтрастная флюоресцентная гибридизация достигается благодаря использованию флюоресцентных красителей разного цвета. С помощью двуцветной FISH выявляются тонкие структурные аномалии, например хромосомные транслокации, в том числе и неразличимые при дифференциальном окрашивании.
В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин - красную, гидроксикумарин - голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH (multicolor, или multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).
Значение цитогенетических методов неодинаково при разных онкогематологических заболеваниях. Миелоидные клетки обычно легко кариотипируются при дифференциальном окрашивании, и FISH лишь подтверждает результаты рутинной цитогенетики. Лимфоидные клетки у больных хроническим лимфолейкозом и, особенно, множественной миеломой кариотипировать значительно сложнее из-за низкого уровня пролиферации (даже при использовании В-клеточных митогенов). В этом случае FISH демонстрирует в несколько раз большую частоту анеуплоидии, чем обычные цитогенетические методики.
Клиническое значение цитогенетических исследований
Диагноз . Потомство клетки с приобретенной цитогенетической аномалией может иметь пролиферативное преимущество и давать начало клону - клеточной популяции, происходящей от одной клетки-предшественницы. Обнаружение клональных хромосомных аномалий способствует постановке диагноза клонального поражения костного мозга. Например, цитогенетический анализ позволяет установить диагноз миелодиспластического синдрома у пациентов с умеренной цитопенией или при наличии в аспирате костного мозга минимально выраженных качественных нарушений гемопоэза.